神经科学家经常研究神经元电生理学——大脑内神经元的电活动——以便更好地理解可能导致特定行为以及与大脑有关的疾病的过程，如精神分裂症、阿尔茨海默病和帕金森氏病。
以细胞为目标的贴片钳是一种已被证实的测量单个神经元电活动的技术，但手工操作是极具挑战性的，特别是 体内;它需要一个双光子显微镜和一个显微操作器的同时操作来引导移液管接触到完整大脑中的目标细胞(细胞经常会随着移液管的运动而运动，因此需要多次调整移液管位置以补偿细胞的运动)，并应用刚好足够的吸力来突破细胞膜(图1)。世界上少数能够手动夹住目标细胞 在体内 的研究人员，其成功率约为20%。
图1所示。测量单个神经元的电活动体内与cell-targeted patch-clamping。
在麻省理工学院媒体实验室和麦戈文研究所的爱德华·博伊登的研究小组工作时，我开发了一个系统，可以自动定位细胞的补丁钳 体内，使得更多的神经科学家可以在他们的实验室中应用这项技术。用MATLAB实现® 应用程序，我的Imagepatcher软件处理来自双光子显微镜的图像，向四轴微操纵器发送命令，并通过控制电子压力调节器和阀门施加吸力。在活老鼠的大脑中，Imagepatcher系统的最初实施表现得和有经验的神经科学家一样好，成功率与他们相当或超过他们。
手动贴片夹紧是如何工作的
Cell-targeted patch-clamping是一个多级的过程当吸管的一角开始进入接触目标细胞(图2)。手动完成第一阶段,研究人员使用一个双光子显微镜来确定目标细胞显微操纵器来操纵吸管进入视野。用一只手操作显微镜，另一只手操作微操作器，研究人员通过多轮显微镜聚焦和视野调整，逐渐将移液管尖端移向目标细胞，小心地补偿移液管尖端接近细胞膜时细胞的运动。
图2。细胞靶向贴片钳合过程的各个阶段。ACSF =人工脑脊液;红色 =荧光细胞;绿色 =填充荧光染料的贴片移液管;红光=双光子成像激光器;黑色实心箭头=移液管移动;黑色虚线箭头=单元格移动;黄色=目标细胞充满了从移液管中提取的荧光染料。
在移液管尖端测量的电阻的突然变化确认尖端与电池接触。此时，研究人员必须迅速将微观用子的重点变为注射器。通过中空管连接到移液管后部的注射器，用于向移液管施加吸入以帮助建立一个 gigaseal，移液管尖端与与移液管尖端接触的细胞膜贴片之间密封紧密; giga 表示大于1g欧姆的电阻(1 GΩ)。然后，研究人员应用一系列吸引脉冲来实现 在是指提供进入细胞内部途径的细胞膜补丁的破裂。这个州被称为 全细胞配置，可以高质量地记录细胞的电活动。为了获得高质量的录音，研究人员必须在整个过程中尽可能减少对细胞的损伤。
在MATLAB中访问和控制实验室设备
为了使patch-clamp过程中涉及的大量手动操作自动化，我需要在MATLAB和所涉及的三种仪器之间建立一个接口:双光子显微镜、微操作器、电子压力调节器和控制移液管尖端压力的阀门(图3)。显微镜的接口由 ScanImage提供，该显微镜控制开源软件包由 维护Vidrio技术．我使用扫描仪控制图像采集的各个方面，包括何时以及如何从显微镜中捕获图像进行MATLAB处理。微操作器的接口由制造商(Sensapex)提供一个库。我使用这个库从MATLAB内以匀速控制移液管的运动。我开发了使用国家仪器数据采集(DAQ)板和仪表控制工具箱™的调节器和阀门接口。
图3. ImagePatcher设置。
实现Imagepatcher控制循环
imagePatcher软件包括三个主控制循环。每个循环都在MATLAB中运行。第一个管理移液管的运动，直到其尖端接触目标神经元，第二次施加抽吸以形成涂料，并且第三施加吸脉冲以实现突破。在修补程序夹紧过程中，ImagePatcher软件自主运行这些控制循环。基于MATLAB的界面使研究人员能够管理和监控程序（图4）。
图4. imagePatcher接口。
用于第一控制回路的算法从显微镜获取图像，分析它以识别单元，计算电池和移液管尖端之间的偏移，并将命令发送到微操纵器，以将移液器移近电池。重复这些步骤，直到移液管达到其目标，通过在移液管尖端测量的电阻突然变化来信号。
在此循环中，我调用图像处理功能以分析显微镜生成的图像。首先，我使用2D维纳滤波器去除光子噪声，这在图像中显示为高强度斑点。接下来，我应用一个阈值化函数来生成隔离荧光标记的单元的图像的二进制版本。然后，我对二进制图像进行形态操作以确定 封面 的细胞-细胞边界内的点，我用移液管的目标。在循环开始之前，我使用了一个类似的程序，在图像中隔离吸管并识别其针尖(图5)。针尖的初始位置用于计算在循环中吸管运动之后的针尖位置。该算法在计算三维细胞质心与移液管尖端之间的偏移量后，生成移动移液管所需的微操作器命令，并通过串行接口将命令发送给微操作器。
图5。图像处理步骤:检测(A)目标细胞的质心和(B)移液管尖端，显示(i)原始显微镜图像，(ii)滤过图像，(iii)二值图像，以及(iv)二值图像与检测特征的叠加。红色的轮廓=细胞的轮廓;红色x =细胞质心;黄色的星号=移液管尖端。
移液管达到电池后，ImagePatcher进入压力控制回路。这里，该算法通过使用MATLAB和数据采集工具箱™在吸移尖端在吸移液尖端产生压力，以为其四个电子阀门的三个电子压力调节器和数字信号产生模拟信号。该算法动态地改变压力，直到在尖端测量的电阻达到1GΩ。压力控制算法使用启发式速度加速缩放的形成 - 例如，如果测量的电阻远低于1GΩ并缓慢上升，则该算法显着增加了吸力，而如果电阻稳步上升，则保持现有的压力和等待吉格萨斯形式。
第三和最终控制回路用于破坏细胞膜。最初，imagePatcher在实现Gigaseal之后自动启动了这个循环，但同事指出，一些研究人员更倾向于在突破之前拍摄录音（即，录音）。电池附加的记录不提供与整个细胞记录相同的信息水平（例如，子阈值活动），但有些研究需要从完整的细胞中记录。为了适应此要求，在进行第三个控制循环之前，将配置映像标记器暂停并等待操作员确认。
为了启动侵入，Imagepatcher应用一系列压力增加的吸入脉冲，同时再次监测在移液管尖端测量到的阻力。当细胞膜破裂时，测量电阻从1 GΩ以上下降到几百兆欧姆。当入侵实现后，Imagepatcher停止吸力，研究人员可以开始记录。
初步结果和计划中的改进
第一个版本的Imagepatcher与经验丰富的研究人员报告的成功率相匹配或略高于，在大约20-22%的时间内实现了全细胞配置。Imagepatcher完成一个贴片夹紧程序所需的10分钟左右的时间与这些研究人员所需的时间相当。自动贴片夹住后的录音时长(平均约15分钟)和质量与手动贴片夹住程序后的录音相当，这表明Imagepatcher不会比手动贴片夹住程序对电池造成更大的损害。最重要的是，Imagepatcher提供了手工方法无法比拟的一致性和一致性，使更多的研究人员能够可靠地执行程序。事实上，世界上已经有7家实验室对使用Imagepatcher表示了兴趣。
我计划实现一些增强，通过利用硬件执行无法手工执行的技术的能力(例如精确应用吸吸脉冲模式)来提高Imagepatcher的速度和成功率。
